生物制药微课堂|第三期-单克隆抗体药物的电荷变异体表征
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单克隆抗体是复杂的糖蛋白，通常呈现微观不均一性，包括各种修饰形成的变异体。这些变异体可能来自复杂的细胞培养工艺、纯化及制剂等制造过程或储存过程的任何阶段。由于抗体所带电荷差异造成的异质性称为电荷变异体，这些变异体可能会影响抗体的稳定性，药效，免疫原性等，因此对电荷变异体的表征和质控至关重要。通过对变异体的分子量及肽图的表征，可以确定其修饰种类及后续QC中的质量监控。
本期微课堂为您带来：
单克隆抗体药物电荷变异体分析解决方案
赛默飞提供两种方案，让您的分析选择更灵活，轻松应对！
方案1：在线CEX-MS方案
本期微课堂来自NIBRT的Jonathan Bones报告，介绍了如何使用在线CEX-MS的分析方法快速在完整蛋白水平上表征变异体修饰。
Advances in Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Using pH Gradient Cation Exchange Chromatography hyphenated to Mass Spectrometry
要点1：
电荷变异体分析常用的PH梯度或盐梯度方法，其流动相一般含不挥发性盐，需要色谱分离后再接馏分，除盐冻干再进质谱分析，这一复杂过程容易造成样品损失及蛋白变性。因此在线CEX-MS的分析方法能够很好的解决这一问题，通过使用低离子强度、挥发性盐的流动体系，在PH梯度条件下分离电荷变异体，同时进质谱分析，能够快速在完整蛋白水平上表征变异体修饰，包括C端赖氨酸变异体、脱酰胺、焦谷氨酸环化、糖化以及抗体相关片段等。
CVA-MS on Q Exactive Plus MS
要点2：
对于在线CEX-MS分析，怎样在保证完美的色谱分离度情况下，准确检测每个色谱峰对应的修饰种类？此次报告会详细介绍流动相的选择、PH条件优化及阿达木单抗、西妥昔单抗的具体案例分析，以及如何根据所得数据分析电荷变异体的来源，例如由于宿主细胞残留蛋白的存在而造成单抗降解为不同的片段等。
CEX-MS analysis of Adalimumab
要点3：
Zipchip-MS微流控毛细管电泳质谱作为CEX-MS的互补技术，在电荷变异体分析中有很好的性能，可在更短的分析时间，使用少量样品，得到完整的电荷变异体数据。对于酸性蛋白质，可使用AEX-MS分析，能够在低PH梯度下观测到更多蛋白异构体，如唾液酸化、岩藻糖基化修饰及降解片段等。该部分内容作为CEX-MS的互补技术，会以实际案例来说明如何从全方面表征抗体电荷变异体。
AEX-MS analysis of Ovalbumin
方案2：离线CEX-MS分析方案：
赛默飞离线CEX-MS方案，包括超高效液相Vanquish，馏分收集器，及超高分辨质谱Orbitrap，可以从完整蛋白、亚基及肽图三个层面对离子交换酸碱峰进行深度表征分析。相比在线CEX-MS方案，该方法可以使用非挥发性盐，使CEX的方法优化更简便，但需要增加冻干除盐等步骤，可根据不同需求选择合适方案。
完整分子量分析：
如下图1所示，收集CEX分离所得馏分，经过除盐冻干处理，LC-MS检测，可在完整分子量层面观测到各个馏分的糖型分布情况，大部分糖基化修饰形成酸性峰，C端赖氨酸丢失及酰胺化等修饰形成碱性峰[1]。
图1：CEX馏分完整分子量分析
轻重链分析：
轻重链分析可进一步在分子量层面观测到更多的信息，如加速稳定性实验中，不同的温度及PH条件下，蛋白药物会发生氧化及降解等反应。将CEX分离的馏分经过DTT还原等处理，通过orbitrap检测，在超高分辨的性能下可测得轻链单同位素分子量，并观测到微小变化的修饰峰，下图所示为CEX的某个馏分经DTT还原后的质谱分析结果，测得轻重链及氧化、脱水、糖化等杂质峰[2]。
肽图分析：
肽图分析能够精确定位翻译后修饰位点及发现更低丰度的修饰，如下图所示，通过对三个酸性峰AF1-AF3及碱性峰BF1、BF2馏分进行肽图分析，可确定每个馏分包含的修饰种类及相对含量，相对含量仅为0.01%的修饰也能被准确鉴定，其中红色标注为主要修饰。Orbitrap的超高灵敏度和分辨率能够检测到更多含量的PTMs及序列变异体，尤其对于馏分收集样品，更需要高灵敏度检测方法。
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参考文献：
1. François G, Blandine D, et al. Unbiased in-depth characterization of CEX fractions from a stressed monoclonal antibody by mass spectrometry. mAbs, 2017.
2. Deyun W, Colin W, et al. Characterization of Drug Product-related Impurities and Variants of a Therapeutic Monoclonal Antibody by Higher-energy C-trap Dissociation Mass Spectrometry. Anal. Chem.,2014.
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